Wie epigenetische Veränderungen unsere Gene steuern

Verfasst von Emily Locke

Diese Themen warten auf Sie:

1) Eine der Grundlagen der Epigenetik: Histon-Modifikationen

2) ChIP – eine bedeutende Methode der epigenetischen Forschung

3) Bekannte (und weniger bekannte) PTMs im Überblick

4) Erstklassige Antikörper für epigenetische Untersuchungen (Pan, H3, H4 und H2A)

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„Grüner Tee hilft gegen Krebs!“ – Schon länger weiß man, dass grüner Tee so gesund ist, dass er in Japan sogar die Krebsstatistik verbessert [1]. Doch warum ist das so? Die Antwort auf diese Frage ließ sich erst mit der Epigenetik klären. Der Begriff „Epigenetik“, zusammengesetzt aus den Wörtern Genetik und Epigenese, also der Entwicklung eines Lebewesens, beschreibt ein Forschungsfeld, das sich mit dem Einfluss der Umwelt auf unsere Gene beschäftigt [2]. Es geht also um die Frage, unter welchen Umständen ein Gen angeschaltet und wann es wieder inaktiviert wird. Diese Änderungen der Aktivität eines Gens beruhen dabei nicht auf einer Veränderung der DNA-Sequenz, etwa durch Mutationen oder Rekombination. Grundlage sind vielmehr chemische Veränderungen am Chromatin oder an den Proteinen, die an die DNA binden. Diese epigenetischen Prägungen können zwar nicht im Genotyp nachgewiesen werden, da die DNA-Sequenz nicht verändert wird, sie können aber sehr wohl im Phänotyp beobachtet und auch an Tochterzellen weitergegeben werden [3].

Im Fall des grünen Tees handelt es sich um einen bestimmten epigenetischen Mechanismus, der die Anti-Krebs-Wirkung auslöst: beim Aufbrühen der nicht-fermentierten Teeblätter löst sich der Stoff Epigallocatechin-3-Gallat (EGCG) heraus. Das EGCG reaktiviert daraufhin ein Gen, das für ein Krebs-bekämpfendes Protein kodiert. Dieses Gen ist insbesondere bei älteren Menschen oft methyliert und deswegen stumm. Beim Konsum von grünem Tee wird das Gen also wieder eingeschaltet und kann damit seine Krebs-bekämpfende Wirkung entfalten [2]. Dies ist nur eines von vielen Beispielen aus der Epigenetik, die zeigen, wie Umwelteinflüsse unsere Gene regulieren können. Das aufsteigende Forschungsfeld verspricht in den Augen vieler Wissenschaftler ein besseres Verständnis von Krankheiten und neue Kenntnisse über deren Behandlung.

Eine der Grundlagen der Epigenetik: Histon-Modifikationen

Eine der grundlegenden epigenetischen Mechanismen ist die Modifikation von sogenannten Histonen. Dies sind basische Proteine, die als Bestandteil des Chromatins von essentieller Bedeutung für die Verpackung der DNA sind. Je zwei Kopien der Histone H2A, H2B, H3 und H4 bilden einen Proteinkomplex aus acht Histonen. Dieses Histon-Oktamer bildet den Kern eines Nukleosoms, um den die DNA gewickelt ist. Ein solches Nukleosom stellt die kleinste Verpackungseinheit der DNA dar [4]. Aus ihm ragen die Enden der Histon-Stränge heraus, welche das Ziel von Histon-modifizierenden Enzymen sind (s. Abb. 1). Die ersten Beschreibungen von post-translational modifizierten Histonen stammen bereits aus den 1960er Jahren. Damals hatte man bei der Analyse von Histonen aus Kälber-Thymi methylierte Lysine detektiert und kurze Zeit später konnten auch acetylierte Lysine nachgewiesen werden [5, 6]. Die Methylierung und Acetylierung von Lysinen stellen heute die bekanntesten Histon-Modifizierungen dar. Doch es wurden darüber hinaus viele weitere post-translationale Modifikationen (PTM) an Histonen gefunden, die eine wichtige Rolle in der Regulation der Genexpression spielen (vgl. Abb. 1).

Histon-Modifikationen können sowohl an den unstrukturierten N- und C-terminalen Enden der Histon-Proteine als auch in dem globulären Bereich innerhalb des Nukleosomen-Kerns auftreten (Abb. 1). Um die verschiedenen Modifikationen zu bezeichnen, hat sich eine spezielle Nomenklatur entwickelt: Zuerst wird der Name des Histons genannt (z. B. H3). Darauf folgt die betroffene Aminosäure in ihrem Einbuchstabencode (z. B. K für Lysin) mit der Position der Aminosäure im Protein. Nun wird die Art der Modifikation genannt (z. B. Me für Methyl, P für Phosphat oder Ac für Acetyl). Zuletzt kann zusätzlich die Anzahl der Methylgruppen (bei Lysinen und Argininen) angegeben werden [7]. So steht beispielsweise die Bezeichnung H3K4me3 für eine Trimethylierung des Lysins an Position 4 des Histons 3.

Abbildung 1: Post-translationale Modifikationen der Histone H2A, H2B, H3 und H4. Dargestellt sind die vier wichtigsten PTM Methylierung, Acetylierung, Ubiquitinierung und Phosphorylierung. Sie treten sowohl an den N- und C-terminalen Enden der Histon-Proteine als auch in dem globulären Bereich innerhalb des Nukleosomen-Kerns auf [8].

ChIP – eine bedeutende Methode der epigenetischen Forschung

Bevor wir einen genaueren Blick auf einzelne post-translationale Histon-Modifikationen und ihre Auswirkungen auf die Genexpression werfen, soll zunächst noch eine der grundlegenden Methoden der epigenetischen Forschung näher beleuchtet werden: die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP). Mit dieser Methode können die Interaktionen von Proteinen mit bestimmten DNA-Abschnitten in intakten Zellen analysiert werden [9]. Dabei soll herausgefunden werden, ob die untersuchten Proteine mit spezifischen Genregionen assoziiert sind [10]. Mit Hilfe von ChIP können beispielweise die Bindung von Transkriptionsfaktoren an Promotoren, aber auch die Verteilung verschiedener Histon-Modifikationen und damit die Basis der epigenetischen Genregulation untersucht werden [11].

Das Grundprinzip besteht darin, die zu einem Zeitpunkt bestehende Protein-DNA-Bindung durch Fixierung mit Formaldehyd festzuhalten (Abb. 2). Anschließend wird die aus den Zellen extrahierte DNA durch Behandlung mit Ultraschall in Bruchstücke von 50 bis 1000 Basenpaaren fragmentiert, wobei die gebundenen Proteine an der DNA verbleiben. In einem nächsten Schritt werden die DNA-Stücke, die mit dem Protein von Interesse assoziiert sind, selektiv mit einem für das DNA-assoziierte Protein spezifischen Antikörper extrahiert. Anschließend werden die isolierten DNA-Protein-Komplexe durch Hitzebehandlung wieder aufgelöst (Abb. 2). Die freien DNA-Fragmente können nun aufgereinigt und mithilfe weiterer Methoden (zum Beispiel PCR, NGS) quantifiziert sowie identifiziert werden. Daraus lässt sich schlussfolgern, ob bzw. wie stark das Protein in der lebenden Zelle mit dem betreffenden DNA-Abschnitt assoziiert war [12].

Abbildung 2: Arbeitsablauf der Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP). Zunächst wird die Bindung zwischen der DNA und assoziierten Proteinen fixiert. Danach wird die DNA durch Ultraschallbehandlung in 50 bis 1000 bp lange Fragmente geschnitten. Mit Hilfe eines Antikörpers, der spezifisch für das DNA-assoziierte Zielprotein ist, werden die DNA-Protein-Komplexe selektiv immunpräzipitiert. Nach Auftrennung des isolierten Komplexes kann die DNA aufgereinigt und ihre Sequenz bestimmt werden [13].

Die Antikörper, die in ChIP genutzt werden, müssen eine hohe Qualität aufweisen, damit das Experiment erfolgreich ist. Unser Hersteller Assay Genie bietet eine große Auswahl an erstklassigen ChIP-Antikörpern, die sowohl für häufige als auch neuartige PTM validiert sind. Hierzu zählen sowohl bekannte Modifikationen wie Methylierung oder Acetylierung als auch ziemliche Exoten wie Neddylierung oder SUMOylierung [14]. 

Methylierung

Die Methylierung stellt den Gegenspieler zur Acetylierung dar und ist das bekannteste epigenetische Signal. Neben Histonen kann auch die DNA direkt methyliert werden. Dabei werden die Methylgruppen an ein Cytosin-Nukleotid innerhalb einer Cytosin-Guanin-Sequenz (CpG) durch DNA-Methyltransferasen angehängt [14]. Frisch methylierte CpGs führen zur Rekrutierung von sogenannten Repressor-Proteinen, die die Interaktion zwischen der DNA und den Transkriptionsfaktoren inhibieren. Dadurch wird die Genexpression in dem jeweiligen Erbgutabschnitt unterbunden. Im Falle von methylierten Histonen wird die Histon-Konformation geschlossen, sodass keine Transkription der Gene mehr möglich ist [3]. Man findet Histon-Methylierungen sowohl an Lysinen als auch an Argininen [7]. 

Phosphorylierung

Die Phosphorylierung beschreibt einen Prozess, bei dem eine Phosphatgruppe von ATP durch eine Proteinkinase an ein Molekül addiert wird. Die Rückreaktion, die sogenannte Dephosphorylierung, wird von Proteinphosphatasen durchgeführt. Die Histon-Phosphorylierung kann an Aminosäuren mit einer Hydroxygruppe (Serin, Threonin und Tyrosin) stattfinden. Durch das Einfügen einer Phosphatgruppe steigt die negative Ladung des Histons signifikant an, wodurch die Struktur des Chromatins verändert wird. Histon-Phosphorylierungen sind in ihrer Funktion sehr divers und können sowohl zur Aktivierung als auch Inaktivierung der Genexpression beitragen [7].

Ubiquitinierung

Die Ubiquitinierung beschreibt das Anhängen von Ubiquitin, einem aus 76 Aminosäuren bestehenden Protein, an ein anderes Protein. Damit wird das Zielprotein für die Degradation durch das Proteasom oder durch Lysosomen markiert. Es sind drei Haupttypen der Ubiquitinierung bekannt: die Mono- und Polyubiquitinierung sowie die „Multisite Monoubiquitinierung“. Während bei der Monoubiquitinierung nur ein Ubiquitinmolekül an das Protein angehängt wird, werden bei der Polyubiquitinierung mehrere Moleküle an ein einziges Protein geknüpft. Bei der „Multisite Ubiquitinierung“ werden mehr als ein Ubiquitinmolekül an einen einzelnen Lysinrest des Zielproteins gehängt [14]. Die Ubiquitinierung von Histonen geht mit einer Aktivierung der eukaryotischen Genexpression einher, jedoch sind die molekularen Grundlagen dieser Regulation noch weitestgehend unbekannt [15].

Beta-Hydroxy-Butyrylierung

Nachdem wir einen Blick auf vier der wichtigsten und bekanntesten PTM geworfen haben, wenden wir uns jetzt noch etwas „exotischeren“ Modifikationen zu. Diese erfreuen sich zwar keiner großen Popularität, haben aber trotzdem interessante Effekte auf die betroffenen Proteine. Ein Beispiel für einen solchen Exoten ist die Beta-Hydroxy-Butyrylierung. Hierbei handelt es sich um einen Prozess, bei welchem Enzyme einen Ketonkörper, das Beta-Hydroxybutyrat, an Histone knüpfen. Diese Modifikation kann die Struktur und somit die Funktion der betroffenen Histon-Proteine beeinflussen. Beta-Hydroxy-Butyrylierung wurde mit einer Vielzahl von Krankheiten, die mit Histonen assoziiert sind, in Verbindung gebracht und könnte daher ein spannendes Ziel für neuartige Therapien darstellen [14].

SUMOylierung

Die SUMOylierung ist eine PTM, bei der sogenannte SUMO-Proteine kovalent an Lysinreste anderer Proteine binden. SUMO-Proteine (small ubiquitin-related modifier) haben eine strukturelle Ähnlichkeit zu Ubiquitin und bilden eine hochkonservierte Proteinfamilie in allen Eukaryoten. Die SUMOylierung spielt eine wichtige Rolle in vielen zellulären Prozessen, darunter die Protein-Protein-Interaktion, der nukleocytoplasmatische Transport, die Signaltransduktion und die Zellzyklus-Regulation [16]. Auch die Proteinstabilität kann durch diese Modifikation beeinflusst werden: SUMOylierte Proteine sind oft stabiler als nicht-modifizierte Proteine [14].

Neddylierung

Die Neddylierung beschreibt eine PTM, bei der das Ubiquitin-ähnliche Protein NEDD8 (neural-precursor-cell-expressed developmentally down-regulated 8) an das Zielprotein konjugiert wird. Dabei wird eine Isopeptidbindung zwischen der Carboxygruppe des C-terminalen Glycins von NEDD8 und der Ɛ-Aminogruppe eines Lysins im Zielprotein gebildet. Der Prozess verläuft analog zur Ubiquitinierung, jedoch sind andere Enzyme involviert. Die Neddylierung spielt eine entscheidende Rolle in verschiedenen zellulären Vorgängen, wie beispielsweise in der Transkription, bei Zellkontakten und der Regulation des Ubiquitin-Proteasom-Systems. Eine Desregulation der Neddylierung kann zu der Entwicklung unterschiedlicher Krankheiten beitragen, darunter Krebs, neurodegenerative Erkrankungen und Herzerkrankungen [17].

Crotonylierung

Als letzte PTM schauen wir uns noch kurz die Crotonylierung an. Bei dieser erst kürzlich entdeckten Modifikation wird ein Crotonyl-CoA-Molekül an einen Lysinrest des Zielproteins gehängt. Dabei handelt es sich meistens um die Ɛ-Aminogruppe von Lysinen in Histonen. Crotonyl-CoA ist der Thioester zwischen Crotonsäure und Coenzym A. Es kommt als Metabolit beim Abbau der Aminosäuren L-Lysin und L-Tryptophan vor. Crotonylierung betrifft viele verschiedene Proteine, darunter Histone, Transkriptionsfaktoren und Enzyme. Sie beeinflusst die Funktion sowie die Stabilität der Proteine. Je nach Lokalisation des Crotonyl-CoA-Moleküls kann die Aktivität des Zielproteins erhöht oder erniedrigt werden. Auch bei dieser Modifikation wird vermutet, dass sie einen Einfluss auf die Entstehung von Krankheiten wie Krebs haben könnte [18].

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Erstklassige Antikörper für epigenetische Untersuchungen

Epigenetische Veränderungen treten im Verlauf eines Lebens um ein Vielfaches häufiger auf als genetische Mutationen [19]. Daher sind sich viele Wissenschaftler sicher, dass die Epigenetik in Zukunft Antworten auf einige altersassoziierte Krankheiten geben wird, die genetisch bisher nicht erklärbar waren. Epigenetische Untersuchungen könnten also Anstöße für innovative Therapien geben und dadurch neue Wege in der medizinischen Forschung eröffnen.

Grundlegend dafür ist die Analyse epigenetischer Veränderungen, wie beispielsweise von Histon-Modifikationen. Die hier beschriebenen post-translationalen Modifikationen stellen eine kleine Auswahl der bekannten PTM dar. Sie wollen sich gerne über weitere Modifikationen informieren? Dann schauen Sie auf dieser Seite unseres Herstellers Assay Genie vorbei! Außerdem finden Sie hier eine Übersicht über Assay Genies umfassende Auswahl an hoch-validierten Antikörpern für die Chromatin-Immunpräzipitation.

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Pan-spezifisch

Histon H3

Histon H4

Histon H2A

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Quellen

[1] https://www.ruprecht.de/2019/11/12/gutes-fuer-die-gene/, letzter Zugriff: 11.01.2023

[2] https://www.planet-wissen.de/natur/forschung/epigenetik/index.html, letzter Zugriff: 11.01.2023

[3] https://de.wikipedia.org/wiki/Epigenetik, letzter Zugriff: 11.01.2023

[4] https://de.wikipedia.org/wiki/Histon, letzter Zugriff: 11.01.2023

[5] Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. ACETYLATION AND METHYLATION OF HISTONES AND THEIR POSSIBLE ROLE IN THE REGULATION OF RNA SYNTHESIS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 51(5):786-794 (1964).

[6] Murray, K. The Occurrence of Ɛ-N-Methyl Lysine in Histones. Biochemistry. 3, 10-15 (1964).

[7] https://de.wikipedia.org/wiki/Histonmodifikation, letzter Zugriff: 11.01.2023

[8] https://www.rockland.com/resources/histone-modifications/, letzter Zugriff: 11.01.2023

[9] https://www.assaygenie.com/chip-antibodies, letzter Zugriff: 11.01.2023

[10] Buck, MJ, Lieb, JD. ChIP-chip: considerations for the design, analysis, and application of genome-wide chromatin immunoprecipitation experiments. Genomics. 83(3):349-60 (2004). 

[11] Kimura, H. Histone modifications for human epigenome analysis. J Hum Genet. 58(7):439-45 (2013). 

[12] https://en.wikipedia.org/wiki/Chromatin_immunoprecipitation, letzter Zugriff: 11.01.2023

[13] https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Chromatin_immunoprecipitation_sequencing.svg

[14] https://www.assaygenie.com/epigenetic-antibodies, letzter Zugriff: 11.01.2023

[15] https://gepris.dfg.de/gepris/projekt/5293400?context=projekt&task=showDetail&id=5293400&, letzter Zugriff: 11.01.2023

[16] Gareau, J., Lima, C. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 861–871 (2010). 

[17] Kandala S, Kim IM, Su H. Neddylation and deneddylation in cardiac biology. Am J Cardiovasc Dis. 4(4):140-58 (2014).

[18] Ntorla A, Burgoyne JR. The Regulation and Function of Histone Crotonylation. Front Cell Dev Biol. 9:624914 (2021).

[19] https://flexikon.doccheck.com/de/Epigenetik, letzter Zugriff: 11.01.2023

Preview-Bild: https://unsplash.com/de/fotos/Iy7QyzOs1bo