Indikatoren, die bei der Bindung von Calcium fluoreszieren, haben es Forschern ermöglicht, Veränderungen der freien intrazellulären Calcium-Konzentration mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie, Durchflusszytometrie, Fluoreszenzspektroskopie und Mikroplatten-Readern zu untersuchen. Bei der Auswahl eines fluoreszierenden Calcium-Indikators gibt es eine ganze Reihe von Faktoren zu berücksichtigen:
1. Indikatorform (AM-Ester, Salz oder Dextrankonjugat)
Die Indikatorform bestimmt, welche Zellbeladungstechnik am besten geeignet ist. AM-Ester-konjugierte Calcium-Indikatoren sind zellpermeabel, sodass sie passiv durch intakte Plasmamembranen diffundieren können. Salz- und Dextran-konjugierte Indikatoren sind nicht zellpermeabel und erfordern eine disruptive Beladung der Zellen durch Mikroinjektion, Patch-Pipette, Elektroporation oder pinocytische Beladungsmittel, oder sie werden für extrazelluläre Assays verwendet.
2. Modus (Einzelwellenlängen- & ratiometrische Indikatoren)
Fluoreszierende Ionen-Indikatoren fallen in zwei Kategorien: Einzelwellenlängen- oder ratiometrische Indikatoren. Für die qualitative Analyse werden Einzelwellenlängen-Indikatoren empfohlen. Ihr großer dynamischer Bereich und ihre unterschiedlichen Dissoziationskonstanten machen sie empfindlich bei der Erkennung von moderaten und kurzzeitigen Calciumveränderungen. Nach Calcium-Chelatisierung erhöhen Einzelwellenlängen-Indikatoren ihre Fluoreszenzintensität um mehr als das 100-fache. Für die quantitative Messung von Ionenkonzentrationen werden ratiometrische Indikatoren empfohlen. Ratiometrische Indikatoren besitzen die einzigartige optische Eigenschaft, dass sich die Intensitäten ihrer optimalen Absorptions- oder Emissionswellenlängen bei der Bindung an freies Calcium verändern. Aus diesen photometrisch gemessenen Verhältnissen können die intrazellulären Calcium-Konzentrationen genau bestimmt werden, da die Auswirkungen von Fehlerquellen wie ungleichmäßige Farbstoffbeladung, Farbstoffaustritt, Photobleichung und Änderungen des Zellvolumens reduziert werden.
3. Optische Eigenschaften
Die Anregungs- und Emissionswellenlängen der Indikatoren hängen weitgehend von der Art der Messgeräte, der Anregungsquelle und der zu verwendenden Probe ab. Beispielsweise kann ein langwelliger Indikator wie Calbryte™ 630 AM für die Messung der Calcium-Konzentration in tieferen Geweben oder in Kombination mit einem grünen Calcium Indikator mit kürzerer Wellenlänge genutzt werden.
4. Dissoziationskonstante (Kd)
Die Dissoziationskonstante beschreibt, wie fest ein Indikator Calcium-Ionen binden kann. Ihr Wert entspricht der Konzentration, bei der die Hälfte der Indikatoren an Calcium gebunden sind. Wählen Sie daher einen Indikator aus, der einen geeigneten Kd-Wert hat, der mit dem relevanten Calcium-Konzentrationsbereich kompatibel ist. Die Kd-Werte von Calcium-Indikatoren sind von vielen Faktoren abhängig, darunter pH-Wert, Temperatur, Ionenstärke, Viskosität, Proteinbindung und das Vorhandensein von Mg2+ und anderen Ionen. Kd-Werte für intrazelluläre Indikatoren sind in der Regel höher als die entsprechenden Werte, die in zellfreien Lösungen gemessen werden.
Was ist ein AM-Ester?
Die Abkürzung "AM" steht für eine Acetoxymethylgruppe und AM-Ester werden in erster Linie für die Modifikation von negativ geladenen Carboxylatverbindungen verwendet. Solche negativ geladenen Verbindungen sind von Natur aus nicht zellpermeabel und erfordern invasive Ladetechniken. Die Modifikation mit AM-Estern maskiert die negativ geladenen Carboxylatgruppen und erzeugt ungeladene hydrophobe Indikatoren oder Chelatoren. Die resultierenden zellpermeablen AM-Derivate können zur Analyse in lebende Zellen diffundieren. Einmal in der Zelle, hydrolysieren (spalten) unspezifische intrazelluläre Esterasen die AM-Gruppen. Die Abspaltung der AM-Gruppen führt zu stark fluoreszierenden Indikatoren oder Chelatoren, die im Zytoplasma gut erhalten bleiben.
