Revolutionierung der Zytokinforschung: InVivoKines™ von AdipoGen Life Sciences

Verfasst von Emily Locke

Die Bedeutung von Antikörpern, T- und B-Lymphozyten, dendritischen Zellen, Makrophagen und Co. für die Abwehr von Krankheitserregern ist eindeutig. Doch neben diesen allgemein bekannten Abwehrkomponenten gibt es auch die stillen Helden unseres körpereigenen Immunsystems wie beispielsweise Zytokine. Diese kleinen Signalproteine sind für die Zellkommunikation unerlässlich, da sie als Botenstoffe des Immunsystems dienen und daher eine entscheidende Rolle bei der Regulierung von Immunantworten, Entzündungen und der Hämatopoese spielen. Außerdem gehört das Einleiten der Proliferation und Differenzierung von Zielzellen zu ihren Aufgaben [1]. Zytokine werden unter anderem von Makrophagen, B- und T-Lymphozyten, natürlichen Killerzellen und Fibroblasten gebildet [2]. Aufgrund ihrer zentralen Rolle bei der Immunantwort stellen sie ein attraktives Ziel für die präklinische und klinische Erforschung einer Vielzahl von Immunkrankheiten dar. Doch trotz ihres Potentials ist die Untersuchung dieser dynamischen Moleküle in lebenden Organismen eine herausfordernde Aufgabe. Schuld daran sind die kurze Halbwertszeit im Blut, Pleotropie und eine ungünstige Biodistribution [3].

Hier kommt unser Hersteller AdipoGen Life Sciences mit einer innovativen Produktlinie ins Spiel: Die InVivoKines™ sind eine neue Generation von Fusionsproteinen mit verbesserter Aktivität und Stabilität für Ihre in vivo-Forschung! Sie ermöglichen es Wissenschaftler*innen, tiefer in die komplexe Welt der Zytokine in lebenden Organismen einzutauchen, neue Erkenntnisse zu gewinnen und Türen zu wirksamen Therapien zu öffnen. Hier erfahren Sie mehr über die Technologie, die hinter den InVivoKines™ steckt, und erhalten einen Überblick über die unterschiedlichen Produktarten und ihre Anwendungen.

Diese Themen warten auf Sie:

1) Was sind InVivoKines™?

2) Was hinter den InVivoKines™ steckt: die Knobs-into-Holes-Technologie

3) „Ausgeschaltete“ InVivoKines™: die LALA-PG-Mutationen

4) InVivoKines™: Proteine mit verbesserter Aktivität und Stabilität für die in vivo-Forschung

5) Wirksame monomere Zytokine: Interleukin-2

6) Hochaktive heterodimere Zytokine: Interleukin-27

7) Einzigartige homodimere Zytokine: GDF-15

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Was sind InVivoKines™?

Bei den InVivoKines™ von AdipoGen Life Sciences handelt es sich um rekombinante Fusionsproteine – doch was genau bedeutet das eigentlich? Ein Protein bezeichnet man als rekombinant, wenn es künstlich mit Hilfe von gentechnisch veränderten Mikroorganismen oder in Zellkulturen hergestellt wird [4]. Ein Fusionsprotein entsteht durch die gemeinsame Expression zwei verschiedener Gene oder Genabschnitte, die hintereinander im Genom liegen. In dem Proteinmolekül sind also Genprodukte von mindestens zwei verschiedenen Genen enthalten [5].

In vielen Fällen kann das Fusionieren von Proteindomänen dazu beitragen, dass die Stabilität bzw. die Halbwertszeit des Proteins erhöht wird [3]. Hierzu nutzt man oft die Fc-Domäne von Antikörpern. Kurz zur Wissensauffrischung: Antikörper bestehen aus zwei Fragmenten, der variablen Fab-Domäne und der konstanten Fc-Domäne (Abb. 1). Während die Fab-Domäne für die Antigenbindung zuständig ist, übernimmt die Fc-Domäne die Effektorfunktionen des Antikörpers, indem sie an Fcγ-Rezeptoren auf Immunzellen bindet oder das Komplementsystem aktiviert [6]. Darüber hinaus sorgt die Fc-Domäne für eine lange Halbwertszeit des Antikörpers, weshalb sie oft für Fusionsproteine in in vivo-Studien verwendet wird [3].

Abbildung 1: Vergleich der Struktur eines Antikörpers und eines Fc-Fusionsproteins. Ein Antikörper besteht aus einer variablen Fab-Domäne und einer konstanten Fc-Domäne. Ein herkömmliches Fc-Fusionsprotein besteht aus einer Fc-Domäne und einem Zielprotein. Aufgrund der Dimerisierung der Fc-Domäne entsteht ein homodimeres Fusionsprotein.

Doch das Fusionieren eines Proteins mit einem Fc-Fragment hat mehr Auswirkungen als nur die Erhöhung der Halbwertszeit: Da eine Dimerisierung für die Aktivierung der Fc-Domäne notwendig ist, entsteht beim Fusionieren dieses Fragments an ein Zielprotein ein homodimeres Protein (Abb. 1). In vielen Fällen ist das von Vorteil, da einige Proteine in Form eines Homodimers aktiver sind. Bei anderen Proteinen kann die Dimerisierung durch Fc-Fragmente ihre Aktivität jedoch auch drastisch senken. Dies ist insbesondere bei Zytokinen oder Interleukinen ein Problem, da sie normalerweise als Monomer oder Heterodimer vorliegen [3].

Was hinter den InVivoKines™ steckt: die Knobs-into-Holes-Technologie

Wie ist es möglich, ein langlebiges Fc-Fusionsprotein für die in vivo-Forschung zu entwickeln, das als Monomer oder Heterodimer, aber nicht als Homodimer vorliegt? Mit den selbstentwickelten InVivoKines™ hat unser Hersteller AdipoGen Life Sciences die Antwort auf diese Frage gefunden und erfolgreich umgesetzt. Dazu nutzt unser Immunologie-Spezialist eine im Jahre 1996 von Ridgway et al. vorgestellte Methode namens Fc-Knobs-into-Holes oder kurz Fc-KIH [7]. Traditionell zur Entwicklung bispezifischer Antikörper eingesetzt, ermöglicht diese bahnbrechende Technologie die Heterodimerisierung zweier verschiedener Fc-Fragmente, wodurch eine Struktur mit zwei unterschiedlichen „Armen“ entsteht. Dies ermöglicht das Herstellen von natürlich vorkommenden, aktiven monomeren oder heterodimeren Fusionsroteinen – so auch von Zytokinen (Abb. 2). 

Abbildung 2: Vergleich der Struktur eines klassischen Fc-Fusionsproteins und eines Fc-KIH-Fusionsproteins. Während die herkömmlichen Fc-Fusionsproteine als Homodimere vorliegen, ermöglicht die KIH-Technologie darüber hinaus die Entwicklung monomerer und heterodimerer Fusionsproteine.

Doch wie genau erhält man die zwei verschiedenen Fc-Arme? Dazu werden wichtige Aminosäurereste, die an der dimeren Interaktion von Fc beteiligt sind, manipuliert. Aminosäurereste mit einer kleinen Seitenkette werden durch solche mit größeren ersetzt, wodurch in der einen Kette ein Knubbel oder Knob entsteht. Umgekehrt werden in der Partnerkette Aminosäurereste mit einer großen Seitenkette durch kleinere ersetzt, um ein Loch oder Hole zu erzeugen. Üblicherweise wird eine T366Y-Mutation in einer C_H3-Domäne genutzt, um einen Knob zu erschaffen, während eine Y407T-Mutation in der anderen C_H3-Domäne ein Hole verursacht. Solche Mutationen führen zu intermolekularen Wechselwirkungen und fördern die Bildung von Heterodimeren durch die Paarung von Knob und Hole [3].

„Ausgeschaltete“ InVivoKines™: die LALA-PG-Mutationen

Wie bereits erwähnt, binden Fc-Fragmente an Fcγ-Rezeptoren (FcγRs) auf Immunzellen oder aktivieren das Komplementsystem. Dadurch können sie verschiedene immunologische Mechanismen auslösen, darunter die antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (antibody dependent cell mediated cytotoxicity, ADCC), die antikörperabhängige zellvermittelte Phagozytose (antibody dependent cell mediated phagocytosis, ADCP) und die komplementabhängige Zytotoxizität (complement dependent cytotoxicity, CDC) [3]. Neben FcγRs binden Fc-Fragmente außerdem an den neonatalen Fc-Rezeptor, kurz FcRn. Die Bindung an diesen Rezeptor verhindert den Abbau der Antikörper bzw. Fusionsproteine und verlängert somit ihre Halbwertszeit im Blut [8].

Obwohl die Effektorfunktionen der Fc-Domäne ein wichtiger Bestandteil unserer Immunabwehr sind und unter anderem bei der Bekämpfung von Tumorzellen eine entscheidende Rolle spielen, kann es für bestimmte Forschungsexperimente interessant sein, Fc-Domänen einzusetzen, denen diese Funktionen fehlen. Deswegen bietet AdipoGen die InVivoKines auch mit „abgeschalteten“ (silenced) Fc-KIH-Domänen an. Hierzu werden die hlgG1 P329G LALA-Mutationen, kurz LALA-PG, verwendet, welche die Interaktionen mit FcγRs und dem Komplementsystem unterdrücken – die Interaktion mit dem FcRn bleibt jedoch unbeeinflusst (Abb. 3) [3]. Der Vorteil von den InVivoKines™ LALA-PG besteht somit darin, dass auf der einen Seite die immunologischen Nebenwirkungen aufgrund der Fc-KIH-Fusionsdomäne vermieden werden, auf der anderen Seite die erhöhte Halbwertszeit in vivo jedoch erhalten bleibt.

Abbildung 3: Inhibierung der Fc-Effektorfunktionen durch LALA-PG-Mutationen. Die LALA-PG-Mutationen verhindern das Auslösen verschiedener immunologischer Mechanismen (darunter ADCC und ADCP) sowie die Aktivierung des Komplementsystems (CDC). Die Bindung zum neonatalen Fc-Rezeptor und die damit verbundene erhöhte Halbwertszeit in vivo bleibt jedoch erhalten.

InVivoKines™: Proteine mit verbesserter Aktivität und Stabilität für die in vivo-Forschung

Jetzt kennen Sie die Hintergründe der InVivoKines^TM. Haben wir Ihr Interesse geweckt? Dann entdecken Sie hier die verschiedenen Produkte, die diese neue Produktlinie mit sich bringt und die Ihre immuntherapeutische, präklinische und translationale in vivo-Forschung unterstützen können. Alle InVivoKines^TM von AdipoGen weisen die folgenden Qualitätsmerkmale auf:

• Native Konformation – Herstellung in HEK 293- oder CHO-Zellen
• Produktion unter tierversuchsfreien Bedingungen
• Hohe Bioaktivität getestet durch ELISA/Zell-basierte Assays
• Geprüfte Reinheit & Homogenität durch SEC
• Niedrige Endotoxin-Werte
• Konsistenz von Charge zu Charge

Werfen Sie außerdem einen Blick in AdipoGens Broschüre (s. rechts), in der Sie weitere, detaillierte Informationen rund um die InVivoKines^TM finden können.

Wirksame monomere Zytokine: Interleukin-2

Interleukin-2 (IL-2) ist ein Zytokin aus der Familie der Interleukine, dessen Hauptwirkung in der autokrinen Stimulation von T-Helfer-Zellen besteht [9]. Darüber hinaus fördert es die Proliferation und Differenzierung von Effektor-T-Zellen (CD4 und CD8) und natürlichen Killerzellen (NKs) und wird daher häufig in der Zelltherapie mit Tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TILs) zur Förderung der T-Zell-Expansion eingesetzt. Das IL-2-Superkine (monomeric):Fc-KIH von AdipoGen Life Sciences induziert eine wirksame Antitumorreaktion und kann sowohl in vitro als auch in vivo eingesetzt werden. Das IL-2-InVivoKine™ ist aufgrund seiner hohen Aktivität und langen Halbwertszeit im Blut insbesondere für in vivo-Studien einzigartig [3].

Hochaktive heterodimere Zytokine: Interleukin-27

Interleukin-27 (IL-27) ist ein Zytokin aus der IL-12-Familie und kann verschiedene Signalwege anschalten, darunter den JAK-STAT- und p38 MAPK-Signalweg. Dabei können sowohl pro- als auch anti-inflammatorische Antworten hervorgerufen werden [10]. IL-27 besteht aus zwei Untereinheiten, IL-27p28 und EBI3. Das IL-27 (mouse):Fc-KIH (human) (rec.) von AdipoGen Life Sciences ist ein heterodimeres Fc-KIH-Konstrukt, das an den IL-27-Rezeptor von Maus und Mensch bindet und so die Stat3-Phosphorylierung aktiviert. Aufgrund seiner heterodimeren Struktur zeigt das IL-27-InVivoKine™ eine höhere Aktivität als herkömmliche IL-27-Fc-Konstrukte [3].

Einzigartige homodimere Zytokine: GDF-15

Der Wachstumsdifferenzierungsfaktor 15 (growth differentitation factor 15, GDF-15) hat vielfältige Wirkungen, unter anderem auf die Appetitregulierung, den Stoffwechsel, die Schwangerschaft und auf Immunantworten. GDF-15 wird momentan für die Behandlung vieler Stoffwechselkrankheiten, einschließlich Fettleibigkeit und Typ-2 Diabetes mellitus, sowie für Herz-Kreislauf-Erkrankungen erforscht. Das Fc (LALA-PG)-KIH (human):GDF15 (mouse) (rec.) von AdipoGen Life Sciences ist ein einzigartiges Protein mit lang anhaltender hoher Aktivität für in vivo-Studien. Während andere klassische GDF-15-Fc-Proteine große, inaktive Aggregate formen, bildet das GDF-15-InVivoKine™ ein biologisch aktives Homodimer [3]. 

Sie sind auf der Suche nach Zytokinen mit höherer Aktivität und Halbwertszeit für Ihre in vivo- oder in vitro-Studien? Dann ist die neue Produktlinie InVivoKines™ unseres Herstellers AdipoGen Life Sciences genau das Richtige für Sie! Überzeugen Sie sich selbst von der Qualität und den Vorteilen dieser innovativen Lösungen für Ihre Zytokinforschung.

Quellen

[1] https://de.wikipedia.org/wiki/Zytokin, 03.06.2024

[2] https://flexikon.doccheck.com/de/Zytokin, 03.06.2024

[3] https://adipogen.com/invivokines/, 03.06.2024

[4] https://flexikon.doccheck.com/de/Rekombinant, 03.06.2024

[5] https://flexikon.doccheck.com/de/Fusionsprotein, 03.06.2024

[6] https://flexikon.doccheck.com/de/Fc-Fragment, 03.06.2024

[7] Ridgway JB, Presta LG, Carter P. 'Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization. Protein Eng. 1996 Jul;9(7):617-21.

[8] https://flexikon.doccheck.com/de/Neonataler_Fc-Rezeptor, 03.06.2024

[9] https://flexikon.doccheck.com/de/Interleukin-2, 03.06.2024

[10] https://en.wikipedia.org/wiki/Interleukin_27, 03.06.2024