Labeling-Kits von AAT Bioquest bringen Farbe ins Labor!

Verfasst von Emily Locke

Diese Themen warten auf Sie:

1) Vergleich der Labeling-Kits von AAT Bioquest

2) ReadiLink^TM Rapid Antibody Labeling-Kits

3) BSA-kompatible ReadiLink^TM xtra Rapid Antibody Labeling-Kits

4) Buccutite^TM Protein-Protein Labeling-Kits

5) Buccutite^TM HRP und Poly-HRP Antibody Labeling-Kits

6) Buccutite^TM Rapid PE, APC, PerCP und Tandem Dye Antibody Labeling-Kits

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Wer sitzt jetzt zur Sommerzeit nicht gerne draußen mit einem Glas Weißweinschorle und genießt die Sonne? Mit etwas Glück kann einem bei solch einem entspannten Abend eine bahnbrechende Entdeckung unterlaufen: So hat der irische Physiker und Mathematiker Sir George Gabriel Stokes 1852 bei einem Glas Weißwein erstmals das Phänomen Fluoreszenz beobachtet. Sonnenlicht, das durch ein violettes Glasfenster gefiltert wurde, traf auf eine Flasche mit Chininwasser, woraufhin blaues Licht emittiert wurde. Dieses blaue Licht durchquerte ein Glas Weißwein, welches das violette Licht aus dem Fenster herausfilterte und lediglich das blaue Licht des Chinins zurückließ [1]. Stokes bemerkte dieses blaue Licht und erkannte damit die Gesetzmäßigkeit, dass das von fluoreszierenden Stoffen wieder emittierte Licht eine größere Wellenlänge hat als das zuvor absorbierte Licht – eine Regel, die mittlerweile als Stokes-Verschiebung bekannt ist [2].

Heutzutage findet Fluoreszenz insbesondere in der Forschung vielfältige Anwendungen: Fluoreszierende Tags werden beispielsweise für das Lebendzell-Imaging, bei der Durchflusszytometrie oder für die Immunfluoreszenz eingesetzt. Für diese Anwendungen ist es notwendig, Antikörper oder Ziel-Proteine mit einem spezifischen, fluoreszierenden Tag zu markieren. Durch dieses sogenannte „Labeln“ sind die Antikörper bzw. Proteine dauerhaft mit dem jeweiligen Fluoreszenzfarbstoff verbunden. Als Tags können neben Fluoreszenzfarbstoffen auch Enzyme oder Haptene, wie beispielsweise Biotin, verwendet werden. Diese Tags werden unter anderem beim Blotting, in ELISAs oder für die Isolierung und Aufreinigung von Proteinen eingesetzt [3].

Eine typische Markierung besteht aus einer bindenden Gruppe (Kopplungsgruppe), eventuell einem Verbinder (Linker) und einem nachweisbaren Molekül (Reporter) [4]. Unser Hersteller AAT Bioquest, ein Spezialist im Bereich Fluoreszenz- und Lumineszenz-Technologien, bietet eine umfangreiche Auswahl an Kits für das Markieren von Antikörpern und Proteinen sowie von anderen Biopolymeren wie Nukleinsäuren und Kohlenhydraten an. Im Folgenden wollen wir Ihnen eine Übersicht über die führenden Produktlinien geben, darunter ReadiLink^TM und ReadiLink^TM xtra zum einfachen Labeln von Antikörpern mit Fluoreszenzfarbstoffen sowie Buccutite^TM für die Protein-Protein-Konjugation.

ReadiLink^TM Rapid Antibody Labeling-Kits

Die ReadiLink^TM Labeling-Kits stellen eine schnelle und praktische Methode dar, um Antikörper mit Fluorophoren wie AATs iFluor®- oder mFluor^TM-Farbstoffen zu markieren. Sie sind für vielfältige Anwendungen geeignet, darunter Fluoreszenzmikroskopie, Multi-Color Imaging, Multiplex-Durchflusszytometrie, Immunhistochemie (IHC) und vieles mehr. Die ReadiLink^TM Rapid Antibody Labeling-Kits bieten den Vorteil, dass das hergestellte Produkt nicht aufgereinigt werden muss und dass der gesamte Prozess der Konjugation nur eine Stunde dauert. Außerdem ist es möglich, Mikrogramm-Mengen an Antikörpern zu labeln, wobei 100% der eingesetzten Antikörper zurückgewonnen werden [3].

Das Protokoll für die Labeling-Reaktion beinhaltet lediglich zwei einfache Schritte: Zunächst mischen Sie Ihre vorbereitete Antikörper-Lösung mit einer Konzentration von 1 mg/mL mit dem ReadiLink^TM-Reaktionspuffer und fügen diese Mischung zu ihrem Fläschchen mit vorformulierten Markern, die im Kit enthalten sind, hinzu (Abb. 1). Diese Marker binden selektiv an primäre Amine auf dem zu markierenden Antikörper, wie z.B. Lysinreste, und ermöglichen somit die Herstellung kovalent markierter Konjugate. Nach einem Inkubationsschritt von 30 bis 60 Minuten fügen Sie den TQ^TM-Quench-Puffer hinzu (Abb. 1). Dieser Puffer eliminiert sowohl die Notwendigkeit eines Aufreinigungsschrittes als auch die Hintergrundinterferenz. Nach weiteren 10 Minuten Inkubation sind die konjugierten Antikörper einsatzbereit [3].

Abbildung 1: Workflow der Antikörpermarkierung mit dem ReadiLink^TM Rapid Antibody Labeling-Kit. Mit nur wenigen, einfachen Schritten ermöglicht Ihnen AATs Kit die zuverlässige Markierung Ihrer Antikörper: Nachdem Sie ihre Antikörperlösung hergestellt haben, fügen Sie Reaktionspuffer hinzu und mischen die Lösung mit dem gewünschten Labeling-Farbstoff (im Kit enthalten). Nach 30 bis 60 Minuten Inkubation fügen Sie den TQ^TM-Quench-Puffer hinzu und inkubieren die Mischung für weitere 10 Minuten. Et voilà: Schon sind Ihre Konjugate „ready-to-use“ [3]!

BSA-kompatible ReadiLink^TM xtra Rapid Antibody Labeling-Kits

AATs ReadiLink^TM xtra Rapid Antibody Labeling-Kit stellt eine Erweiterung der bereits beschriebenen ReadiLink^TM Rapid Antibody Labeling-Kits dar. Es besitzt genau die gleichen Vorteile (beispielsweise das unglaublich schnelle und simple Protokoll oder die Elimination eines Aufreinigungsschritts), ist aber darüber hinaus mit BSA und anderen stabilisierenden Proteinen bzw. Proteingemischen (z.B. Gelatine) kompatibel [3]. Während solche üblichen Pufferzusätze bei den ReadiLink^TM Rapid Antibody Labeling-Kits vorher entfernt werden müssen, können Sie ihre BSA-enthaltenden Antikörper-Lösungen mit diesem Kit ohne Probleme direkt für die Labeling-Reaktion verwenden!

Buccutite^TM Protein-Protein Labeling-Kits

Während die ReadiLink^TM-Kits das schnelle Markieren von Antikörpern mit Fluoreszenzfarbstoffen ermöglichen, können Sie die Buccutite^TM Labeling-Kits für die Protein-Protein-Konjugation verwenden. Dies ermöglicht Ihnen die kovalente Markierung Ihrer Proteine und Antikörper mit Enzymen oder Phycobiliproteinen [3]. Im Gegensatz zur konventionellen SMCC-Methode ist die Konjugation mit der Buccutite^TM-Technologie weniger anspruchsvoll und extrem zeitsparend: Während das Labeln über SMCC die Aufreinigung des Produktes erfordert und der gesamte Prozess somit vier oder mehr Stunden einnimmt, sind Konjugate mit der Buccutite^TM-Technologie ohne einen Aufreinigungsschritt innerhalb von zwei Stunden einsatzbereit. Darüber hinaus sind die Konjugate äußerst stabil und überstehen daher auch die gründlichen Waschschritte, die typischerweise bei Immunassays (z.B. ELISA, IHC und Western Blot) oder bei der Durchflusszytometrie erforderlich sind [5].

• Buccutite^TM Rapid Protein Crosslinking Kit *Microscale Optimized for Crosslinking 100 ug Antibody per Reaction*

Buccutite^TM HRP und Poly-HRP Antibody Labeling-Kits

Sie wollen Ihren primären Antikörper mit dem Detektionsenzym Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidase, HRP) markieren? Dann sind die Buccutite^TM HRP und Poly-HRP Antibody Labeling-Kits genau das Richtige für Sie! Diese Kits ermöglichen die Markierung mit HRP in unter zwei Stunden und die erhaltenen Konjugate sind ideal für verschiedene Anwendungen wie ELISA, IHC, Western Blotting und TSA (tyramide signal amplification) Imaging. Außerdem sind die Konjugate äußerst stabil und somit für eine langfristige Lagerung geeignet. Sie lassen sich bei +4 °C bis zu 12 Monate aufbewahren [5].

HRP ist ein Metalloenzym, das als eines der häufigsten Reporterenzyme in der Biochemie Anwendung findet. Sie wird industriell aus Meerrettich isoliert – daher auch der ungewöhnliche Name – und ermöglicht die Herstellung von optisch aktiven Hydroperoxiden [6]. HRP-Konjugate alleine sind recht nutzlos, da die Peroxidase ein Substrat benötigt, um ein messbares Signal zu erzeugen. Je nach eingesetztem Substrat kommt es zu einer Chemilumineszenz-, Fluoreszenz- oder einer Farbreaktion. Während die Umsetzung chemilumineszenter Substrate (z.B. Luminol) Nebenprodukte erzeugt, welche mit Hilfe eines Luminometers erfasst werden können, kann die Umsetzung eines Substrats für Fluoreszenz (z.B. Amplite®) mit verschiedensten Fluoreszenzgeräten gemessen werden. Farbstoffbasierte Substrate (z.B. ABTS, TMB) werden bereits seit Jahren eingesetzt, wobei die entstehende Farbänderung durch einen Absorptions-Mikroplatten-Reader quantifiziert wird. Durch ihre Kompatibilität mit verschiedensten Substraten ermöglichen HRP-Konjugate eine gewisse Flexibilität im experimentellen Design [5].

Mit AATs Buccutite^TM-Kits können Sie ihre Antikörper innerhalb von 2 Stunden mit einem HRP-Molekül markieren. Dazu müssen Sie Ihren Antikörper lediglich mit dem im Kit enthaltenen Buccutite^TM MTA-Linker aktivieren und eine Stunde mit der Buccutite^TM Folsäure (FOL)-aktivierten HRP inkubieren – und schon sind Ihre Konjugate einsatzbereit (Abb. 2)!  Die Buccutite^TM HRP Antibody Labeling-Kits sind in drei verschiedenen Größen erhältlich, die für das Markieren von 25 µg, 100 µg und 1 mg Antikörper pro Labeling-Reaktion optimiert sind. Darüber hinaus bietet AAT Buccutite^TM Poly-HRP Antibody Labeling-Kits an, welche das direkte Markieren von Antikörpern mit HRP-Polymeren ermöglichen. Diese Konjugate erreichen ein höheres Level an Sensitivität und ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis. Somit sind sie ideal für Anwendungen, bei denen das Zielprotein in geringer Menge vorhanden ist oder das Probenvolumen begrenzt ist [5].

Abbildung 2: Workflow des Buccutite^TM Peroxidase (HRP) Antibody Labeling-Kits. Der Antikörper wird zunächst durch einen 30-minütigen Inkubationsschritt mit dem im Kit enthaltenen MTA-Linker aktiviert. Danach wird der nun an den Linker gekoppelte Antikörper für 60 Minuten mit dem FOL-aktivierten HRP-Enzym inkubiert und ist anschließend einsatzbereit [5]. 

Buccutite^TM Rapid PE, APC, PerCP und Tandem Dye Antibody Labeling-Kits

Die Buccutite^TM-Technologie ermöglicht Ihnen aber nicht nur die Konjugation von HRP an Ihre Antikörper – Sie können auch Markierungen mit Phycobiliproteinen, wie beispielsweise Phycoerythrin (PE), Allophycocyanin (APE) oder dem Peridinin-Chlorophyll-Protein (PerCP), vornehmen. Diese sogenannten Chromoproteine bestehen aus einem Proteinanteil sowie einer chromophoren Gruppe [7] und sind in der Lage, intensivere Fluoreszenzsignale als jeder kommerziell erhältlicher, synthetischer Fluorophor zu erzeugen [5]. Sie werden insbesondere für Anwendungen eingesetzt, die eine hohe Sensitivität, aber geringe Fotostabilität erfordern, wie zum Beispiel bei der Durchflusszytometrie, beim FACS (fluorescence activated cell sorting) oder der Immun-phänotypisierung. Darüber hinaus ermöglichen Phycobiliproteine multiparametrische Analysen: Indem sie mit kleinen organischen Fluorophoren, wie FITC (Fluorescein-Isothiocyanat), PE, PE-Cy5 oder PE-Cy7 markiert werden, entstehen Tandem-Farbstoffe mit einer sehr großen Stokes-Verschiebung (hier wären wir wieder beim Weißwein ?), die trotz gleicher Anregungsquelle eine hervorragende spektrale Trennung aufweisen [5]. In AATs Katalog „PE & APC Tandem Dyes“ erfahren Sie mehr über diese innovativen Farbstoffe!

Das Protokoll für die Konjugation der Phycobiliproteine an einen Antikörper ist genau so simpel wie für das Markieren mit HRP (Abb. 3). Nach nur zwei Schritten ist das Konjugat bereits einsatzbereit, eine Aufreinigung ist auch bei diesem Kit nicht notwendig. Sie können ebenfalls zwischen drei verschiedenen Größen je nach Antikörpermenge pro Labeling-Reaktion (25 µg, 100 µg oder 1 mg) wählen und die hergestellten Konjugate bei +4 °C bis zu 12 Monate lagern [5].

Abbildung 3: Workflow des Buccutite^TM Rapid Antibody Labeling-Kits für Phycobiliproteine. Der Antikörper wird zunächst durch einen 30-minütigen Inkubationsschritt mit dem im Kit enthaltenen MTA-Linker aktiviert. Danach wird der nun an den Linker gekoppelte Antikörper für 60 Minuten mit dem FOL-aktivierten Phycobiliprotein (z.B. PE, APC, PerCP oder ein Tandem-Farbstoff) inkubiert und ist anschließend einsatzbereit [5]. 

*Größe für alle Kits: 2 Labelings

Werfen Sie gerne einen Blick in AATs Labeling-Broschüre für weitere Details über die verfügbaren Farbstoffe zum Markieren von Proteinen. Außerdem können Sie sich in diesem Blogartikel über klassische Labeling-Fluoreszenzfarbstoffe informieren.

Fluoreszenz- oder Lumineszenz-Technologien im Allgemeinen könnten für Ihre Forschung interessant sein? Dann stöbern Sie doch mal durch die anderen Produkte von AAT Bioquest und bringen Sie Farbe in Ihr Labor!

Quellen

[1] Stokes, G.G. XXX. On the change of refrangibility of light. Phil. Trans. R. Soc. 142: 463-562 (1852).

[2] https://www.edinst.com/blog/what-is-the-stokes-shift/, 12.08.2023.

[3] https://www.aatbio.com/catalog/antibody-and-protein-labeling, 12.08.2023.

[4] https://de.wikipedia.org/wiki/Molek%C3%BClmarkierung, 12.08.2023.

[5] https://www.aatbio.com/catalog/bioconjugation-protein-to-protein, 12.08.2023.

[6] Veitch NC. Horseradish peroxidase: a modern view of a classic enzyme. Phytochemistry. 65(3): 249-59 (2004).

[7] Aráoz R, Lebert M, Häder DP. Electrophoretic applications of phycobiliproteins. Electrophoresis. 19(2): 215-9 (1998).

Preview-Bild: https://www.aatbio.com/catalog/antibody-and-protein-labeling