Originalartikel von Rockland Immunochemicals
Diese Themen warten auf Sie:
1) GFP existiert in verschiedenen Varianten
2) Monoklonale vs. polyklonale GFP-Antikörper
3) GFP-Antikörper aus verschiedenen Wirtsspezies
4) Merkmale und Vorteile von Ziegen-, Kaninchen-, Hühner- und Mausantikörpern
Das grün fluoreszierende Protein (GFP) hat das Feld der Molekular- und Zellbiologie als wertvolles Instrument zur Verfolgung der Proteinexpression und -lokalisierung in lebenden Zellen revolutioniert. GFP ist ein 27 kDa großes, zytoplasmatisches Protein, das erstmals aus der Qualle Aequorea victoria gewonnen wurde. Um den Nutzen von GFP in bestimmten Anwendungen wie Western Blotting, Immunpräzipitation und Fluoreszenzmikroskopie zu maximieren, benötigen Forschende zuverlässige und spezifische GFP-Antikörper.
Dieser Artikel unseres Lieferanten Rockland Immunochemicals gibt einen detaillierten Überblick über GFP-Antikörper von Huhn, Ziege, Maus und Kaninchen und zeigt auf, wie sie in der wissenschaftlichen Forschung eingesetzt werden können.
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GFP existiert in verschiedenen Varianten
Es wurden verschiedene GFP-Varianten entwickelt, um die Nachteile des Wildtyp-GFP, wie geringere Helligkeit, Fluoreszenzintensität und Verwendbarkeit in bestimmten Experimenten, zu überwinden (s. Tabelle unten). So reduziert beispielsweise die Mutation von Ser65 zu Thr (S65T) das Anregungsspektrum auf einen einzigen Peak bei etwa 490 nm mit erhöhter Amplitude [1]. Enhanced GFP (eGFP) hat eine sechsmal hellere Fluoreszenz als das Wildtyp-GFP, eine schnellere Reifung und ist weniger empfindlich gegenüber temperaturabhängiger Fehlfaltung. Andererseits photobleachen eGFP und S65T-GFP etwa doppelt so schnell wie Wildtyp-GFP [2]. Eine weitere Variante, RS-GFP, wurde so entwickelt, dass sie ein leicht rotverschobenes Spektrum aufweist, was sie zu einem wertvollen Werkzeug für FRET-Experimente macht. Dies gilt auch für das gelb fluoreszierende Protein (yellow fluorescent protein; YFP), das gelbes Licht anstelle von grünem aussendet.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass GFP-Varianten eine Feinabstimmung der Proteinexpression sowie Lokalisierungsstudien ermöglichen. Was die Spezifität der GFP-Antikörper angeht, so sind die Unterschiede vernachlässigbar, da sich die Varianten nur in wenigen Aminosäuren unterscheiden.
| Variante | Ex [nm] | Em [nm] | Extinkt. Koeff. [M-1cm-1] | Quantenausbeute [Φ] | Helligkeit [nM-1cm-1] | Maturation [min] |
| GFP, rGFP | 395 (475) | 509 | 25.000 | 0,79 | 19,75 | 36 |
| eGFP | 488 | 507 | 55.900 | 0,60 | 33,54 | 25 |
| S65T-GFP | 490 | 510 | 55.000 | 0,64 | 35,2 | - |
| RS-GFP | 493 | 510 | 47.000 | 0,36 | 16,92 | 180 |
| YFP | 513 | 527 | 67.000 | 0,67 | 44,89 | 9 |
*von FPbase [3] abgerufene Daten
Monoklonale vs. polyklonale GFP-Antikörper
Monoklonale GFP-Antikörper werden aus einem einzigen Klon von B-Zellen gewonnen, der identische Antikörper produziert, die spezifisch an ein einziges Epitop binden. Im Gegensatz dazu werden polyklonale GFP-Antikörper aus Serum gewonnen, wodurch ein heterogenes Gemisch von Antikörpern entsteht, die mehrere Epitope erkennen.
Der Hauptvorteil von monoklonalen Antikörpern ist ihre hohe Spezifität und Einheitlichkeit, da die Abweichungen von Charge zu Charge minimal sind. Die Verwendung polyklonaler Antikörper kann jedoch von Vorteil sein, da die heterogene Bindung mehrerer verschiedener Epitope die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass diese Reagenzien GFP unter einer Vielzahl verschiedener Testbedingungen und bei verschiedenen Immunassays erfolgreich binden. Während bei einigen Anwendungen (z. B. Western Blot) denaturiertes Protein nachgewiesen werden muss, erfordern andere Anwendungen den Nachweis von nativem GFP. Polyklonale Antikörper sind in der Regel besser in der Lage, beide Varianten nachzuweisen.
Da alle hier vorgestellten Anti-GFP-Antikörper in zahlreichen Anwendungen validiert und getestet wurden, sollte man die Kaufentscheidung auf der Grundlage der spezifischen Produktreferenzen und Anwendungen treffen.
GFP-Antikörper aus verschiedenen Wirtsspezies
GFP-Antikörper von verschiedenen Wirtsspezies wie Maus, Kaninchen, Ziege und Huhn bieten unterschiedliche Vorteile bei verschiedenen Anwendungen. Die meisten Unterschiede ergeben sich aus Variationen in Struktur und Antigenität.
Mit Ausnahme der GFP-Antikörper von Vögeln, bei denen es sich in der Regel um IgY-Antikörper handelt, gehören alle anderen gängigen GFP-Antikörper zur Klasse der Immunglobuline G. Ein wesentlicher struktureller Unterschied zwischen IgY- und IgG-Antikörpern liegt in ihren jeweiligen schweren Ketten. IgG-Antikörper haben drei konstante Regionen in ihren schweren Ketten, während IgY-Antikörper vier haben, was das Molekulargewicht von IgY auf 180 kDa erhöht (siehe Abbildung). Das Fehlen der Gelenkregion bei IgY führt zu einer erhöhten Steifigkeit, die es widerstandsfähiger gegen proteolytischen Abbau und im Allgemeinen stabiler als IgG macht. Andere strukturelle Variationen und der phylogenetische Abstand führen zu einer Nicht-Reaktivität gegenüber spezifischen Komponenten des menschlichen Immunsystems, wie z.B. Fc-Rezeptoren, was sie zu einem idealen Werkzeug macht, wenn minimale Interferenz gewünscht ist [4].
In Fällen, in denen ein Kaninchen- oder Ziegenantikörper bevorzugt wird, z. B. wenn bereits ein sekundärer Antikörper verwendet wird, sollte sich die Auswahl an den vom Hersteller getesteten oder in der Literatur zitierten (empfohlenen) Anwendungen orientieren. Antikörper von verschiedenen Wirtsspezies können bei Multiplex-Experimenten von Vorteil sein. Zum Beispiel kann der Nachweis eines Antigens mit einem Maus-Primärantikörper und einem GFP-Antikörper von der Ziege kombiniert werden. Dies ermöglicht den Nachweis von zwei verschiedenen Zielmolekülen in derselben Probe unter Verwendung unterschiedlicher Labels. Multiplex-Experimente können die Effizienz von Experimenten erhöhen und Zeit und Ressourcen sparen, da sie den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Zielproteine ermöglichen.
*Tabelle angepasst von Pereira et al. 2019 [5]
Schlussfolgerung
GFP-Antikörper aus verschiedenen Wirtsarten besitzen einzigartige Eigenschaften, die sie für bestimmte Anwendungen ideal machen. Die Wahl des GFP-Antikörpers hängt von verschiedenen Faktoren ab, darunter die bevorzugte Klonalität, die Wirtsspezies und die beabsichtigte Verwendung des Antikörpers. Produktreferenzen spielen in diesem Entscheidungsprozess eine wesentliche Rolle, da sie wertvolle Informationen über die Leistungsfähigkeit und Zuverlässigkeit bestimmter GFP-Antikörper liefern. Anhand von Produktreferenzen kann man Einblicke in die Leistung des Antikörpers in relevanten Experimenten gewinnen und so eine fundierte Entscheidung treffen. Durch die Wahl des richtigen GFP-Antikörpers für eine bestimmte Anwendung können Sie die Genauigkeit und Effizienz Ihrer Experimente verbessern.
| Produktnummern | Produktname | Antikörper-Typ | Wirtsspezies | Anwendungen |
| 600-101-215 | Anti-Green Fluorescent Protein (GFP) | Polyklonal | Ziege | ELISA, IHC, IFM, IP, WB |
| 600-401-215 | Anti-Green Fluorescent Protein (GFP) | Polyklonal | Kaninchen | ELISA, FC, IHC, IFM, WB |
| 600-901-215 | Anti-GFP (minimum cross reactivity to human, mouse and rat serum proteins) | Polyklonal | Huhn | ELISA, IHC, IFM, WB |
| 600-301-215 | Anti-Green Fluorescent Protein (GFP, recombinant from Aequorea victoria), Klon 9F9.F9 | Monoklonal | Maus | ELISA, FC, IHC, IFM, WB |
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Quellen
[1] Ormö, M., Cubitt, A. B., Kallio, K., Gross, L. A., Tsien, R. Y., & Remington, S. J. (1996). Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Science (New York, N.Y.), 273(5280), 1392–1395.
[2] Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., & Piston, D. W. (1997). Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical journal, 73(5), 2782–2790.
[3] Lambert T. J. (2019). FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature methods, 16(4), 277–278.
[4] Michael, A., Meenatchisundaram, S., Parameswari, G., Subbraj, T., Selvakumaran, R., & Ramalingam, S. (2010). Chicken egg yolk antibodies (IgY) as an alternative to mammalian antibodies. Indian J. Sci. Technol, 3(4), 468-474.
[5] Pereira, E. P. V., van Tilburg, M. F., Florean, E. O. P. T., & Guedes, M. I. F. (2019). Egg yolk antibodies (IgY) and their applications in human and veterinary health: A review. International immunopharmacology, 73, 293–303.
