Anwendungsabkürzungen im Biomol-Webshop - und was sie bedeuten

Verfasst von Ella Roor

In unserem Webshop haben Sie die Möglichkeit, bei Ihrer Produktsuche nach Anwendungen zu filtern, für die die jeweiligen Produkte vom Hersteller validiert wurden. Dies erlaubt Ihnen beispielsweise, schnell einen gesuchten Antikörper zu finden, den Sie in der Immunhistochemie oder beim Western Blot einsetzen können. Mit unserem großen Sortiment decken wir auch eine breite Palette an Anwendungen ab, weshalb wir für eine bessere Übersicht bei der entsprechenden Filteroption oftmals Abkürzungen für die jeweiligen Anwendung verwenden. Doch nicht immer ist diese Abkürzung geläufig. In diesem Artikel möchten wir Ihnen eine Übersicht über einige unserer Anwendungsabkürzungen geben und ein paar ausgewählte Methoden näher erläutern.

Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Der ELISA ist ein immunologisches, auf Antikörpern basierendes Nachweisverfahren zur Untersuchung von Proteinen (z.B. Antikörpern), Viren oder kleinen, biochemischen Molekülen in verschiedenen Probentypen (z.B. Plasma, Serum, Urin). Die Methode zeichnet sich durch eine hohe Spezifität und Sensitivität aus, sodass zuvor gängige Techniken wie der Radioimmunoassay (RIA) nach und nach durch den ELISA ersetzt wurden [1, 2]. Während der Corona-Pandemie hatten und haben ELISAs eine wichtige Rolle bei der Nachverfolgung von Infektionen mit dem SARS-CoV-2-Virus gespielt, insbesondere bei asymptomatischen Infektionen. Um zu prüfen, ob eine Ansteckung mit dem Corona-Virus vorlag, wurde Blut der infizierten Person mittels ELISA auf die für das SARS-CoV-2-Virus spezifischen Antikörper untersucht [3]. Es wird allgemein zwischen vier ELISA-Arten unterschieden:

• Indirekter ELISA
• Direkter ELISA
• Sandwich-ELISA (direkt/indirekt)
• Kompetetiver ELISA
 

Beim indirekten ELISAs wird ein unmarkierter, primärer Antikörper verwendet, welcher spezifisch an das Antigen in der Probe bindet. Im Anschluss wird ein Enzym-konjugierter Sekundärantikörper eingesetzt, der an den ersten Antikörper bindet und die indirekte Detektion des Antigens ermöglicht [4]. Für den direkten ELISA ist bereits der Primärantikörper mit einem Enzym konjugiert, wodurch kein sekundärer Antikörper benötigt wird [4].

Im Vergleich zu den ersten beiden Varianten binden bei dem Sandwich-ELISA zwei Antikörper an zwei verschiedene Epitope des Antigens. Dadurch liegt das Antigen zwischen den beiden Antikörpern, wie in einem Sandwich. Als direkt gilt dieser ELISA-Typ, wenn der zweite Antikörper mit einem Enzym konjugiert ist. Ist dies nicht der Fall, muss ein dritter Antikörper verwendet werden, welcher an ein Enzym gekoppelt ist und die Detektion des Antigens erlaubt (indirekter Sandwich-ELISA) [4].

Der kompetitive ELISA stellt einen Sonderfall dar: Hier wird statt eines zweiten Antikörpers ein konkurrierendes, konjugiertes Antigen eingesetzt. Dieses ähnelt dem Antigen aus der Probe strukturell und konkurriert mit diesem um die Bindungsstelle des  Detektionsantikörpers [5]. Dies hat ein umgekehrt proportionales Verhältnis zwischen der Konzentration des nachzuweisenden Antigens und der Signalstärke zur Folge (geringe Signalstärke = hohe Antigen-Konzentration in der Probe) [5].

Unabhängig vom ELISA-Typ wird zur Detektion des Antigens ein Farbsubstrat zur Probe hinzugefügt. Die Enzyme, die mit den Antikörpern konjugiert sind, setzen das Substrat um, wodurch es zu einem schwach gelben Farbumschlag kommt. Die Intensität des entstandenen Farbumschlags gibt Aufschluss über die Konzentration des untersuchten Antigens in der Probe [1, 6].

Entdecken Sie unsere Auswahl an ELISA und Immunassays 

Durchflusszytometrie (FC)

Die Durchflusszytometrie ist eine analytische Methode, die die Bestimmung der physikalischen und chemischen Eigenschaften von Zellen ermöglicht. Anwendung findet diese Technik z.B. bei dem Nachweis von Infektionen, in der Immunologie oder auch in der Krebsforschung. Für die Durchführung wird ein Durchflusszytometer verwendet, welches aus drei Hauptsystemen besteht: der Fluidik, der Optik und der Elektronik [7].

Das Prinzip hinter der Durchflusszytometrie basiert auf der Markierung von Zellen mit spezifischen, Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelten Antikörpern oder direkt mit Zell- oder Organell-spezifischen Farbstoffen. Die Zellen werden anschließend durch einen schmalen Kanal transportiert, wo sie von einem Laserstrahl angestrahlt und die Elektronen des (fluoreszierenden) Farbstoffes auf ein erhöhtes Energieniveau gehoben werden. Wenn die Elektronen wieder auf ihr ursprüngliches Energieniveau fallen, emittieren sie Licht, was von dem Durchflusszytometer erfasst wird. Die Menge des emittierten Lichts ist dabei proportional zu der Menge der gebundenen Antikörper und somit zur Zellzahl [7, 8]. Die Lichtstreuung und Lichtbeugung, die während dieses Vorgangs stattfinden, ermöglichen die Bestimmung von Größe und Beschaffenheit der Zellen.

Manche Durchflusszytometer erlauben darüber hinaus die Auftrennung bzw. Fraktionierung der Zellen. Sobald die Zellen den Laserstrahl passiert haben, werden sie in kleine Flüssigkeitstropfen verpackt und besitzen positive und negative Ladungen. Durch ein elektrisches Feld werden die Zellen entsprechend ihrer Ladung in sterile Auffanggefäße gelenkt. In diesem Fall spricht man auch von „Fluorescence-activated Cell Sorting“ (FACS). Die gesammelten Daten werden im Anschluss an ein Programm zur Auswertung weitergeleitet und die Ergebnisse in Diagrammen (Dot Plots) dargestellt [7-9].

Hier finden Sie Antikörper für die Durchflusszytometrie 

Immunhistochemie (IHC)

Die Immunhistochemie (IHC) ist ein Verfahren, das hauptsächlich in der onkologischen Diagnostik angewendet wird. Mittels IHC können Tumore identifiziert und klassifiziert werden, sodass entsprechende Prognosen getroffen und Therapieansätze definiert werden können. Außerdem ermöglicht die IHC die Unterscheidung zwischen gesundem und krankem Gewebe. Neben der Identifikation von Tumoren kann die IHC auch zum Nachweis von Infektionserregern wie z.B. Zytomegalie-Viren, humanen Papilloma-Viren und Herpes-Viren eingesetzt werden [10, 11].

Bei diesem Verfahren werden Antikörper verwendet, die die Zielproteine in den untersuchten Zell- oder Gewebestrukturen visualisieren. Das Gewebe muss dafür zunächst fixiert werden, wofür in der Regel Paraformaldehyd verwendet wird. Bei der anschließenden Detektion der Zielproteine wird zwischen zwei verschiedenen Methoden unterschieden: der direkten und der indirekten Färbung [12]. Die direkte Färbung nutzt primäre Antikörper, die an einen Marker (Fluoreszenzfarbstoff oder Enzym) gekoppelt sind. Ist der Marker ein Fluoreszenzfarbstoff (z.B. Fluorescein, Rhodamin oder Texas Red), erfolgt die Detektion des untersuchten Proteins über ein Fluoreszenzmikroskop. Bei Enzymen dagegen wird ein chromogenes Substrat zur Probe gegeben, welches vom Enzym in ein farbiges Reaktionsprodukt umgesetzt wird und somit den Antigennachweis ermöglicht. Häufig verwendete Enzyme sind insbesondere die Meerrettich-Peroxidase (HRP) und die Alkalische Phosphatase (AP) [12].

Im Gegensatz dazu werden bei der indirekten Färbung ein nicht-konjugierter Primär- und ein konjugierter Sekundärantikörper verwendet. Der Sekundärantikörper kann wiederum mit einem Farbstoff oder mit einem Enzym konjugiert sein [11].

Hier finden Sie Antikörper für die Immunhistochemie 

Lateral Flow Assay (LFA)

Lateral Flow Assays (LFA) gehören zu den am häufigsten verwendeten Biosensoren im Bereich der analytischen Detektion. Sie zeichnen sich dadurch aus, dass sie im Vergleich zu anderen Immunoassays (z.B. ELISA oder Western Blot) unkompliziert und kostengünstig sind und schnelle Ergebnisse liefern. Darüber hinaus werden für die Durchführung kein zusätzliches Equipment oder Personal benötigt [13]. Die wohl bekanntesten LFA sind Schwangerschafts- oder Covid-19-Tests. Dabei finden die Assays auch in anderen Bereichen wie z.B. in der Veterinärmedizin, der Lebensmittelsicherheit oder den Umweltwissenschaften Anwendung [14]. Der LFA dient dem Nachweis von Analyten in Flüssigkeiten oder komplexen Gemischen (z.B. Blut, Urin) und nutzt dafür eine Kombination aus Dünnschichtchromatographie und Immunassay [14, 15].

Grundsätzlich sind alle für einen LFA benötigten Komponenten in der Testkassette enthalten (Abb. 1). Der Teststreifen („Membran“) im Inneren der Testkassette besteht aus porösem Papier, welches die Probe aufsaugt und mithilfe von Kapillarkräften innerhalb des Papiers transportiert [14].

Abbildung 1:  Darstellung des grundlegenden Aufbaus eines LFA und der Flussrichtung der Probe. Ein LFA besteht allgemein aus den folgenden Komponenten: Sample pad, Conjugate release pad, eine Membran mit gebunden Antikörpern auf Test- und Kontrolllinie und einem Adsorbent pad. Die Komponenten sind auf einer Backing card fixiert. Nach dem Auftragen der Probe bewegt sich diese durch Kapillarkräfte vom Sample zum Adsorbent pad (verändert nach [14]).

Die Probe wird mit einem Lösungs- bzw. Laufmittel vermischt und auf das „Sample pad“ aufgetragen, welches die Probenflüssigkeit filtriert, sodass der Transport nicht durch Feststoffe innerhalb der Flüssigkeit behindert wird. Die Probe bewegt sich anschließend durch das „Conjugate release pad“, an welchem markierte Primärantikörper immobilisiert wurden. Die Probenflüssigkeit löst diese Antikörper, woraufhin sie an das Antigen binden [14, 16]. Sobald die Probenflüssigkeit das „Conjugate release pad“ passiert hat, bewegt sie sich gemeinsam mit dem konjugierten Antikörper in die Detektionszone zwischen dem „Sample pad“ und dem „Adsorbent pad“. Diese Zone ist eine poröse Membran mit immobilisierten Test- und Kontrolllinien (Abb. 1). Auf der Testlinie sind Antikörper immobilisiert, die gegen ein anderes Epitop des Analyten gerichtet sind. Ist das Antigen in der Probe nachweisbar, erscheint eine abgegrenzte Linie, wobei die Intensität der Färbung direkt proportional zur Antigenkonzentration ist [14, 16].

Auf der Kontrolllinie sind Antikörper immobilisiert, die spezifisch an überschüssigen, markierten Primärantikörper binden und somit den korrekten Ablauf des Tests anzeigen [14]. Falls nur die Testlinie zu sehen ist, deutet dies auf einen fehlerhaften Test hin und der LFA sollte wiederholt werden. Um einen Rückfluss zu verhindern, befindet sich am Ende des Teststreifens außerdem ein „Adsorbent pad“, welches die überschüssige Flüssigkeitsmenge aufnimmt [14, 16].

Hier finden Sie Antikörper für den Lateral Flow Assay 

Western Blot (WB)

Die Methode des Western Blots hat 2019 ihren 40. Geburtstag gefeiert [17]. Edwin Southern entwickelte 1975 das erste Blot-Verfahren, genannt Southern Blot, zum Nachweis von DNA-Fragmenten. An dieses Verfahren angelehnt wurden die Techniken Northern Blot (RNA) und Western Blot (Proteine) eingeführt [18].

Für einen Western Blot müssen die untersuchten Proteine zunächst elektrophoretisch aufgetrennt werden. Zu diesem Zweck können verschiedene Methoden wie z.B. SDS-PAGE, Native-PAGE, isoelektrische Fokussierung oder 2D-Gelelektrophorese eingesetzt werden. Bei einer Auftrennung mittels SDS-PAGE werden die gefalteten Proteine durch den Einsatz von Natriumdodecylsulfat (SDS) und durch Aufkochen denaturiert und linearisiert. Außerdem verdeckt die Bindung des SDS an die Proteine die Protein-Eigenladung, sodass sie eine dauerhaft negative Ladung aufweisen [19, 20]. Während der Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) werden die Proteine entsprechend ihrer Kettenlänge, welche proportional zur Molekülmasse ist, aufgetrennt. Kleine Moleküle können die Gel-Matrix dabei schneller passieren als große Moleküle [20].

Im Anschluss folgt das eigentliche „Blotting“. Dabei werden die aufgetrennten Proteine durch ein senkrecht zum Gel angelegtes, elektrisches Feld auf eine feste Trägermembran wie z.B. Nitrozellulose, Nylon oder Polyvinylidendifluorid (PVDF) übertragen [18]. Die transferierten Proteine binden an das Trägermaterial, wodurch das Auftrennungsmuster erhalten bleibt und die Proteine für nachfolgende Methoden zugänglich gemacht werden [19].

Die häufigste nachfolgende Methode ist die Identifizierung der „geblotteten“ Proteine mittels spezifischer Antikörper (Immundetektion). Diese können entweder gegen das Zielprotein selbst oder gegen ein mit dem Zielprotein verbundenen Tag (z.B. HA- oder GFP-Tag) gerichtet sein. Um unspezifische Bindungen der Antikörper zu verhindern bzw. zu vermindern, können freie Bindungsstellen auf der Membrane z.B. mit Hilfe von BSA blockiert werden. Außerdem sollten die Trägermembranen mit Pufferlösungen gewaschen werden, um Antikörper, die nicht an das Zielprotein gebunden haben, wieder zu entfernen. Der Primärantikörper wird mittels eines gegen ihn gerichteten Sekundärantiköper, der mit einem Konjugat verbunden ist, detektiert. Dies kann beispielsweise ein Farbstoff oder auch ein Enzym sein [19].

Die Methode besitzt eine hohe analytische Sensitivität und Spezifität [21]. Im Vergleich zu anderen analytischen Methoden zeichnet sich der Western Blot dadurch aus, dass eine Bestimmung der Proteingröße, des Proteingehalts (beim Vergleich verschiedener Proben miteinander) und die (Semi-)Quantifizierung der Proteine möglich sind. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass die Verwendung von unterschiedlichen Primärantikörpern auf derselben Trägermembran möglich ist, wodurch verschiedene Proteine aus denselben Proben detektiert und verglichen werden können [19].

Hier finden Sie Antikörper für den Western Blot 

Quellen

[1] Rehm, H., Letzel, T. (2016). Antikörper und Aptamere. In: Der Experimentator: Proteinbiochemie/Proteomics. Experimentator. Springer Spektrum, Berlin, Heidelberg. https://doi.org/10.1007/978-3-662-48851-5_6

[2] https://flexikon.doccheck.com/de/ELISA 16.01.2023

[3] https://www.planet-wissen.de/natur/mikroorganismen/viren/elisa-test-112.html 16.01.2023

[4] https://elisa-kits.de/de/elisa_method 08.02.2023

[5] https://www.uniklinikum-saarland.de/de/einrichtungen/fachrichtungen/zellbiologie/seminar_zellbiologie_20192020/elisa/verschiedene_testformen/ kompetitiver_elisa 17.02.2023

[6] https://www.bionity.com/de/lexikon/Enzymelinked_Immunosorbent_Assay.html 16.01.2023

[7] https://at.vwr.com/cms/flow_cytometry 14.01.2023

[8] Oberle, V., Soßdorf, M., Lösche, W. (2010). Durchflusszytometrie. In: Pötzsch, B., Madlener, K. (eds) Hämostaseologie. Springer, Berlin, Heidelberg. https://doi.org/10.1007/978-3-642-01544-1_74

[9] https://www.laborjournal.de/rubric/methoden/methoden/m_v64.php?consent=1 18.01.2023

[10] https://ipa.med.ovgu.de/Krankenversorgung/Klinische+Pathologie/Immunhistologie.html#:~:text=Das%20wesentliche%20Anwendungsgebiet%20der%20Immunhistochemie,Ansprechen%20auf%20bestimmte%20Therapien%20genutzt.

[11] https://flexikon.doccheck.com/de/Immunhistochemie

[12] https://www.bionity.com/de/lexikon/Immunhistochemie.html 20.02.2023

[13] Jiang, X. & Lillehoj, P.B., Lateral flow immunochromatographic assay on a single piece of paper, Analyst.2021,146 (3),1084-1090, The Royal Society of Chemistry. Doi: 10.1039/D0AN02073G

[14] Koczula KM, Gallotta A. Lateral flow assays. Essays Biochem. 2016 Jun 30;60(1):111-20. doi: 10.1042/EBC20150012. PMID: 27365041; PMCID: PMC4986465

[15] https://flexikon.doccheck.com/de/Lateral-Flow-Test 06.01.2023

[16] Posthuma-Trumpie, G.A., Korf, J. & van Amerongen, A. Lateral flow (immuno)assay: its strengths, weaknesses, opportunities and threats. A literature survey. Anal Bioanal Chem 393, 569–582 (2009). https://doi.org/10.1007/s00216-008-2287-2

[17] Moritz CP. 40 years Western blotting: A scientific birthday toast. J Proteomics. 2020 Feb 10;212:103575. doi: 10.1016/j.jprot.2019.103575. Epub 2019 Nov 6. PMID: 31706026.

[18] https://flexikon.doccheck.com/de/Western_Blot 09.01.2023

[19] https://www.antikoerper-online.de/resources/17/1224/western-blot-gelelektrophorese-fuer-proteine/ 09.01.2023

[20] Al-Tubuly, A.A. (2000). SDS-PAGE and Western Blotting. In: George, A.J.T., Urch, C.E. (eds) Diagnostic and Therapeutic Antibodies. Methods in Molecular Medicine, vol 40. Humana, Totowa, NJ. https://doi.org/10.1385/1-59259-076-4:391

[21] A. M. Gressner und O. A. GressnerIn: Gressner AM, Arndt T, editors. Lexikon der Medizinischen Laboratoriumsdiagnostik. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg; 2019. P.2505-2506