Seit den 1970er Jahren wird die Durchflusszytometrie in der Forschung und Industrie zur Charakterisierung und Sortierung von Zellpopulationen eingesetzt. Dabei können Zellen anhand ihrer physikalischen und molekularen Eigenschaften analysiert und getrennt werden. Das Anwendungsspektrum dieser Technik ist sehr groß. In diesem Blog-Artikel wollen wir einen Einblick in verschiedene Anwendungsmöglichkeiten der Durchflusszytometrie anhand von konkreten Beispielen aus der Forschung geben. Dabei spielen immer wieder Antikörper eine große Rolle, die am besten speziell für die Durchflusszytometrie validiert sein sollten.
Diese Themen warten auf Sie:
1) Wie funktioniert die Durchflusszytometrie?
2) Anwendungsbeispiel 1: Isolation von Krebs-assoziierten Fibroblasten
3) Anwendungsbeispiel 2: Isolation und Transplantation von Muskelsatellitenzellen
4) Verändern FACS-Analysen die Genexpression der untersuchten Zellen?
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Wie funktioniert die Durchflusszytometrie?
Die Durchflusszytometrie (auch FACS für engl. „Fluorescence-activated Cell Sorting“) ermöglicht die Analyse, das Zählen und das Sortieren von Zellen in einem Flüssigkeitsstrom. Heterogene Zellpopulationen können anhand ihrer physikalischen und molekularen Eigenschaften getrennt und bis auf die Einzelzellebene in Echtzeit analysiert werden. Dabei werden mehr als 1000 Zellen pro Sekunde gemessen. Um diese Technik nutzen zu können, müssen die zu untersuchenden Zellen in einer Einzelzellsuspension vorliegen. Anschließend werden sie in einer extrem feinen Glasküvette perlenschnurrartig hintereinander aufgereiht, sodass jede Zelle einzeln auf einen dahinter geschalteten Laser trifft (auch Xenon- oder Argonlampen werden genutzt). Jede Zelle, die den Laserstrahl passiert, emittiert nun Licht, welches von einem Detektor registriert und in Echtzeit am Computer dargestellt wird. Je nach Eigenschaft der Zelle erhält man ein spezifisches, optisches Signal und kann Zellen unterschiedlicher Eigenschaften trennen und dokumentieren.
Dabei können wie bereits erwähnt sowohl physikalische als auch molekulare Eigenschaften gemessen werden. Zu den messbaren physikalischen Eigenschaften gehören: die Größe, Oberflächenbeschaffenheit und Granularität. Zur Unterscheidung anhand molekularer Marker werden Fluoreszenz-gekoppelte Antikörper gegen intrazelluläre oder Oberflächen-Antigene verwendet. Wie bei einem Fluoreszenzmikroskop kann auch bei der Durchflusszytometrie die Probe mit unterschiedlichen Wellenlängen angeregt werden, um markierte Zellen von unmarkierten zu trennen und darzustellen. Ein großer Vorteil dieser Methode ist die Möglichkeit, die Zellen anhand ihrer unterschiedlichen optischen Signale zu separieren und anschließend für Downstream-Anwendungen in getrennten Reaktionsgefäßen zu sammeln. Im Anschluss können verschiedenste, molekularbiologische Untersuchungen wie z.B. RNA/DNA-Analysen, Proteomics oder Western Blot durchgeführt werden. Es ist auch möglich, die isolierten Zellen in Zellkultur zu nehmen.
Abb. 1: Durchflusszytometrie-Instrumente - Wie sie funktionieren. Der Arbeitsablauf der Durchflusszytometrie beginnt mit dem Ansaugen der untersuchten Zellen in das Fluidsystem (1). Für die Messung werden die Zellen hintereinander aufgereiht (2), was die Analyse auf Einzelzellebene ermöglicht. Durch einen Laserstrahl werden die Zellen angeregt, streuen das Licht und emittieren Fluoreszenz in Abhängigkeit von ihren individuellen Eigenschaften (3). Die Fluoreszenzinformationen werden von verschiedenen Sensoren erfasst, die es den Forschenden ermöglichen, Daten über Zellgröße, Granularität und andere Eigenschaften zu sammeln (4). Diese Daten werden anschließend analysiert, um ein umfassendes Bild für jede Probe zu erstellen (5). Verändert nach [1].
Anwendungsbeispiel 1: Isolation von Krebs-assoziierten Fibroblasten
Im Tumorstroma vieler Krebsarten (vor allem beim Mammakarzinom) befinden sich sogenannte Krebs-assoziierte Fibroblasten (CAFs für engl. „cancer-associated fibroblasts“), welche häufig mit einer schlechten Prognose verbunden sind [2]. CAFs sind eine aktivierte Subpopulation stromaler Fibroblasten, von denen viele den Myofibroblastenmarker α-SMA3 exprimieren. Ihren Ursprung haben diese Fibroblasten im lokalen Gewebe oder im Knochenmark und werden erst unter dem Einfluss der Tumormikroumgebung zu CAFs, nachdem sie in das Tumorgewebe rekrutiert wurden. Es wurde gezeigt, dass die CAFs die Proliferation, die Angiogenese und die Invasion der Tumorzellen fördern. Die Arbeit mit CAFs gestaltet sich schwierig, da diese Zellen eine enorme Heterogenität mit vielen Subtypen in der Mikroumgebung eines Tumors aufweisen. Dazu kommt, dass in vitro-Experimente mit Fibroblasten kompliziert sind, da sie häufig ihr Expressionsprofil in Gewebekulturen verändern. Die Forschungsgruppe um Neta Erez hat ein Protokoll zur Isolierung von CAFs und normalen Fibroblasten direkt aus frischem Gewebe mittels Fluorescence-activated Cell Sorting entwickelt, um diese Probleme zu umgehen. Dafür nutzen sie Antikörper gegen den Fibroblasten-Marker PDGFRα, um die gewünschten Zellen zu markieren. Aus dem Ausgangsmaterial wird eine Einzelzellsuspension hergestellt, welche dann mit dem Fluoreszenz-markierten PDGFRα-Antikörper inkubiert wird. Anschließend können so die PDGFRα-positiven Zellen mit Hilfe eines Durchflusszytometers analysiert und ohne Tumorzellenkontamination für weitere Analysen und Charakterisierungen aussortiert werden [2].
Anwendungsbeispiel 2: Isolation und Transplantation von Muskelsatellitenzellen
Kommt es zu einer Verletzung von Muskelgewebe, wird die Regeneration maßgeblich von Myoblasten vermittelt. Ihre Vorläuferzellen sind Muskelsatellitenzellen. Diese Stammzellpopulation ist im erwachsenen Muskel normalerweise mitotisch ruhend. Sie leiten nach einer Verletzung jedoch eine schnelle zelluläre Proliferation ein, um Myoblasten zu produzieren. Aus Satellitenzellen stammende Myoblasten werden als Therapie bei verschiedenen regenerativen Krankheiten wie Muskeldystrophie, Herzversagen oder urologischen Funktionsstörungen untersucht. Durch die Transplantation solcher Zellen in Muskelfasern konnten Funktionsverbesserungen bei den genannten Krankheiten gezeigt werden. Um diese Therapieform zu erforschen und durchführen zu können, ist es von großer Bedeutung, effiziente Aufreinigungsmethoden für ruhende Satellitenzellen aus Skelettmuskulatur zu etablieren [3]. Buckingham et al. haben 2005 eine Methode zur schnellen Isolation dieser Zellart für die Forschung entwickelt [4]. Muskelsatellitenzellen exprimieren das Protein PAX3, durch welches sie im Skelettmuskel identifiziert werden können. Buckingham et al. haben eine PAX3(GFP/+)-Mauslinie verwendet, um Satellitenzellen direkt mittels FACS aus dem Gewebe heraus zu sortieren. Die PAX3-positiven Zellen fluoreszierten ohne weitere Färbe- oder Markierungsschritte grün und konnten so identifiziert und sortiert werden. Die so gewonnen Zellen wurden anschließend in transgene Mäuse transplantiert, die eine Mutation im Maus-Homolog des humanen Dystrophin-Gens (mdx-Gen für engl. „muscular dystrophy x“). Diese Mäuse dienen als etabliertes und international anerkanntes Modell für die Duchenne-Muskeldystrophie, bei der es im Laufe des Lebens zu einer starken Muskelschwäche kommt. Die isolierten und transplantierten Muskelsatellitenzellen führten bei den Mäusen zu einer verbesserten Faserreparatur in den behandelten Skelettmuskeln [4]. Die Durchflusszyometrie eignet sich somit auch, um Zellen für einen medizinischen/therapeutischen Zweck zu isolieren, da sie durch diese Methode weder ihre Fähigkeit zur Teilung noch zur Differenzierung verlieren und vital bleiben.
Verändern FACS-Analysen die Genexpression der untersuchten Zellen?
Die Methode der Durchflusszytometrie als Solche stellt ein vielfältiges Werkzeug zur Sortierung und Charakterisierung heterogener Zellpopulationen dar und kann Forschenden in sehr kurzer Zeit sehr viele Informationen liefern. Häufig ist die Durchflusszytometrie aber nur der erste Abschnitt und mittel zum Zweck, um beispielsweise eine oder mehrere Zellpopulationen zu isolieren, woraufhin oft weitere Downstream-Anwendungen folgen. Von großer Bedeutung sind seit Längerem vor allem Genexpressionsanalysen, etwa mit Hilfe von Microarrays. Hier stellt sich eine wichtige Frage: Verändert die Analyse und Sortierung von Zellen mittels Durchflusszytometrie die Genexpression von den untersuchten Zellen? Graham M. Richardson, Joanne Lannigan und Ian G. Macara haben diese Frage systematisch untersucht und ihre Ergebnisse 2015 veröffentlicht [5]. Sie arbeiteten mit Brustdrüsengewebe von Mäusen und isolierten die RNA exemplarisch nach jedem experimentellen Schritt bis hin zum Sortieren in verschiedenen Durchflusszytometern. Die folgenden Microarray-Analysen zeigten, dass die FACS-Analyse die Genexpressionsmuster der Brustdrüsenzellen nur minimal änderte. Es wurde lediglich eine Hochregulierung von 18 miRNAs beobachtet, die allerdings durch die vorherigen Schritte der Isolierung hervorgerufen wurde. Die Autoren kamen zu dem Schluss, dass die FACS-Analyse sich überraschend wenig auf die Transkriptionsmuster der Zellen ausgewirkt hatte und diese Auswirkungen zusätzlich minimiert werden können, indem die Zellen konstant bei 4°C prozessiert werden [5].
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Referenzen:
[1] IDEX Health & Science, https://www.idex-hs.com/capabilities/life-science-optics/applications/flow-cytometry (zuletzt aufgerufen am 20.12.2023)
[2] Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (71), e4425, doi:10.3791/4425 (2013).
[3] Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells. J. Vis. Exp. (86), e50846, doi:10.3791/50846 (2014)
[4] Margaret Buckingham et al., Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science, 2005 Sep 23;309(5743):2064-7. doi: 10.1126/science.1114758. Epub 2005 Sep 1.
[5] Graham M. Richardson,1 Joanne Lannigan,2 Ian G. Macara, Does FACS Perturb Gene Expression? Published online 13 January 2015 in Wiley Online Library, DOI: 10.1002/cyto.a.22608
