Razor(TM) TEV Protease

Über TEV Protease

TEV-Protease ist eine hoch sequenzspezifische Cysteinprotease aus dem Tobacco Etch Virus (TEV), die gerne für die Entfernung von Protein-Tags verwendet wird. Eine Unit der Biomol Razor™ TEV-Protease spaltet typischerweise >85% von 3 µg eines Kontroll-Substrates innerhalb einer Stunde bei 30°C.

Vorteile der Biomol Razor™ TEV-Protease

Aufgrund ihrer hohen Sequenzabhängigkeit ist die TEV-Protease spezifischer als Faktor Xa, Thrombin oder Enterokinase. Damit ist die TEV-Protease ein sehr leistungsfähiges Tool zur Spaltung von Fusionsproteinen.

Die Spaltungsstelle der TEV-Protease

Die TEV-Protease erkennt ein lineares Epitop der allgemeinen Form E-X-X-Y-X-Q-G/S (Glu, X, X, Tyr, X, Gln, Gly/Ser). Die TEV-Protease schneidet zwischen Q (Gln) und G (Gly) oder S (Ser). Die kanonische Sequenz lautet ENLYFQS, wobei N (Asn) im wesentlichen durch jede beliebige Aminosäure ersetzt werden kann.

Abb. Schematische Darstellung der Proteinspaltung durch die TEV-Protease

Enzymmechanismus der TEV-Protease

Da die TEV-Protease eine Cysteinprotease ist, wird deren Aktivität nicht von Serinproteaseinhibitoren beeinflußt, obwohl der Enzymmechanismus an die katalytische Triade von Serinproteasen erinnert.

Proteaseinhibitoren ohne Einfluß auf die TEV-Protease

PMSF, AEBSF oder Pefabloc SC (1 mM), TLCK (1 mM), Bestatin (1 mg/mL), Pepstatin A, EDTA (1 mM) und E-64 (3 mg/mL) haben keinen Effekt auf die katalytische Aktivität der TEV-Protease. Zink-Ionen inhibieren die Aktivität der TEV-Protease bei Konzentrationen von 5 mM oder darüber.

Biomol Razor™ TEV-Protease

Biomol Razor™ TEV-Protease enthält ein N-terminales Poly-Histidin-Tag (28.6 kDa). Es enthält zusätzlich eine Mutation bei Aminosäure 219 (S219V), die die TEV-Protease vor Autoinaktivierung schützt.

Reaktionsbedingungen

Der Standard-Reaktionspuffer für die TEV-Protease enthält 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT. Die Inkubation sollte bei 30°C über Nacht erfolgen, wobei ein Großteil der Spaltungen in den ersten Stunden erfolgen. Die Inkubation kann auch bei Raumtemperatur oder 4°C mit akzeptablen Einbußen bei der Aktivität erfolgen.

Wie viel TEV-Protease sollte man einsetzen?

Als Daumenregel gilt: 1 µg TEV-Protease für je 25 bis 100 µg Substrat (minimale Enzymkonzentration: 1 unit/ml). Nutze mehr Enzym, wenn die Spaltungsstelle des Substrats schwer zugänglich oder das Substrat aggregiert ist. Unter diesen Bedingungen kann es helfen einen Abschnitt von Glycinen, Histidinen oder ein Flag-Tag zwischen der TEV-Spaltungsstelle und dem N-Terminus des Zielproteins einzubauen. Eine Spaltung direkt auf der Säule wird nicht empfohlen. Die TEV-Protease besitzt ein relativ flaches Aktivitätsprofil bei pH Werten zwischen 4 und 9 (Empfohlen: pH 6.0 bis 8.5). Die TEV-Protease zeigt bei 500 mM NaCl noch 50% ihrer ursprünglischen Aktivität. Die maximale Aktivität erreicht das Enzym bei 34°C. Die Protease toleriert eine Reihe von Puffersubstanzen wie Phosphat, MES oder Acetat. Glycerol oder Sorbitol können bis zu einer Konzentration von 40% (w/v) eingesetzt werden. Detergenzien können einen Effekt auf die Aktivität der Protease haben.

Der Einsatz von DTT

Wenn bei dem Zielprotein Disulfidbrücken bekannt sind oder vermutet werden, sollte DTT nicht bei der Reaktion eingesetzt werden. Als Alternative empfiehlt sich ein Puffer mit 3 mM Glutathion/0.3 mM oxidiertem Glutathion. Wenn das Zielprotein Zink-Finger enthält, kann es eine gute Idee sein, dass DTT durch beta-Mercaptoethanol und das EDTA durch beispielsweise Citrat zu ersetzen.

Wie entfernt man die TEV-Protease nach der Spaltung?

Wenn das Zielprotein kein Poly-Histidin-Tag enthält, kann das Poly-Histidin-Tag der Biomol Razor™ TEV-Protease (DTT und EDTA sollten hierbei vorher entfernt werden) zur Aufreinigung über eine Affinitätsmatrix genutzt werden.